实验设备和方法168体育

　　许多之前在实验室中使用高级设备和熟练技术人员进行的生化检测如 今可由医生、护士或甚至患者他自己/她自己通过使用小的、通常为一次性设 备而进行。这是由于近几十年对生物化学和药物的更好理解，以及机械和电 子的持续微型化的结果。

　　这些检测可被分为两组一步检测，其中在加入样品后在衬底上发生 反应，且结果作为所述村底的一种或多种性质的变化而检测；和两步检测， 其中加入检测结合体后加入样品，导致产生可检测信号的特殊反应。

　　在大多数实验中，该检测结合体和可能的其它反应物被预分配或集成在 设备中，而不考虑使用者对单独加入反应物的需求。

　　最常用类型的一次性实验设备包括接收样品的区或区域、反应区和可选 地分别与接受和反应区连接的传送或培养区。这些实验设备被称为免疫色谱 法实验设备或筒单地称为条带检测。它们使用一种多孔材料，例如硝化纤维 素，限定能支持毛细流动的流体通道。该样品接收区通常由能吸收样品的更 多孔的材料构成，且当需要分离血细胞时，能有效捕获红细胞。这些材料的 示例为纤维材料，如纸、羊毛状物(fleece)、凝胶或组织，包括例如纤维素、 硝化纤维素、羊毛、玻璃纤维、石棉、合成纤维、聚合物等或其混合物。该 传送或培养区通常由相同或相似材料构成，经常具有与样品接收区不同的孔 隙度。同样地，可以与培养区集成或构成其最远部的该反应区，通常由类似 的吸收纤维材料(如硝化纤维素或任何上述材料)构成。

　　反应区的基质。使用硝化纤维素的显著缺点是其高度非特异结合蛋白和其它 生物分子。然而，目前的检测带经常处理过多的样品，降低了该结合的影响。 硝化纤维素的另 一缺点是其涉及化学和物理性质的变化。在任何情况下都期 望最小化样品体积，符合整个检测小型化的趋势，包括最小化反应物的量，

　　在实验设备或条带检测中，该多孔材料装配在载体上，如热塑性材料带、 纸、168体育纸板等。而且，可配有盖子，所述盖子具有至少一个孔用于接收样品， 和用于读出实验结果的孔或透明的区域。

　　US 6,312,888公开了一种实验设备，包括多层，用于分析生物样品中的 分析物。

　　从WO2005/089082已知一种用于处理液体样品的设备，包括具有基本 上垂直于其表面的凸起的区域，其中该凸起产生毛细力。在这些实验设备中， 相比于早期没有产生毛细力的凸起的实验设备，出现了新的问题。

　　现有技术有关实验设备的问题包括如何改善样品的添加，如何改善血液 样品的红细胞压积耐受力，和当使用吸量管添加液体至所述实验设备时如何 防止实验设备被吸量管损坏。

　　本发明的目的是处理已知实验设备相关的缺点，并提供种改善的实验设 备，其至少减少现有技术中存在的一些问题。对本说明书、实施例和权利要 求进一步研究后，已知设备相关的其它缺点和本发明的实施方案相关的优点 对在本领域技术人员将是明显的。

　　本发明制得如权利要求所定义的实验设备，在此引入作为参考。 本发明的其它方面，以及其优点，将会在本领域技术人员对本说明书、 实施例和权利要求进一 步研究后变得明显。

　　本发明将会通过以下说明书、非限制性实施例和权利要求进行详细描 述，参考所附附图，其中

　　图3示意性显示具有流体通道的实施方案和所述流体通道的细节，图了基本上垂直的凸起的尺寸。

　　图4显示具有盖、过滤器、基底(base)和底部(bottom)的实施方案。 发明详述

　　根据对性能有最大影响的标准，实验可被分为两组，所述性能是对于实 验精密度和灵敏度的预期

　　固相三明治(Solid sandwich)实验，使用过量的抗体，也称为免疫测定实验。

　　在竟争实验形式中，抗体的量不足以结合所有的抗原。固定量的标记抗 原与来自样品的未标记抗原竟争有限量的抗体结合位点。样品中抗原的浓度 可由结合至抗体的标记抗原的比例或可替代地由游离的标记抗原的比例而确定。

　　在三明治实验形式中，样品中存在的抗原结合至固相上过量的抗体。然 后结合的抗原用第二标记的抗体检测。在此情况下，固相上捕获的标记抗体 的量直接与样品中抗原的量成比例。

　　在这两种免疫实验的基本设计及其各种变体中，对实验和实验进行的环 境的标准化和控制存在巨大需求。本发明的实施方案解决了与固相横向流动 (lateral flow)免疫实验相关的 一些问题。 一个关键的步骤是检测结合体 (detection conjugate)的增溶和传送。另 一重要的步骤是分离红细胞，其中存 在细胞溶解和血液凝固的高风险。

　　当然本发明并不严格限制于以上实验形式，而是可以改变为本领域技术 人员熟知的其它实验形式。

　　在描述本发明的设备和方法之前，应理解本发明不限定于在此公开的具 体的配置、方法步骤和材料，因为这些配置、步骤和材料可有一些改变。也 应理解本文使用的术语仅是用来描述具体的实施方案，不是为了限制目的， 因为本发明的范围仅由所附的权利要求及其等价物来限定。

　　也应注意，在本说明书和权利要求中使用的单数形式一个(a)、一种 (an)和该(the)包括复数对象，除非上下文清楚地另外指示。因此，例如， 包含一种单克隆抗体(a monoclonal antibody)的反应混合物包括两种或更多 种抗体的混合物。对于本领域技术人员熟悉和可接受的是，术语约用于数值的环境中时 表示精度的区间。所述区间可为± 1.0 %或优选士 5 %。

　　在对本发明进行描述和要求权利保护时，以下术语将根据本文所述的定 义使用。

　　本文的术语样品是指一定体积的液体、溶液或悬浮液，要用于对其任 何性质进行定性的或定量的测定，例如组分的存在或不存在、组分的浓度等。

　　该样品可以为从生物体(例如哺乳动物，优选人)采取的样品；或源自生物 圈，例如水样品或废水(effluent);或源自技术、化学或生物过程，例如制造 过程，例如药物、食品、饲料的生产，或饮用水的纯化或废水的处理。该样 品可原样进行定性的或定量的测定，或经过合适预处理后进行定性的或定量 的测定，例如均匀化、超声处理、过滤、沉降、离心、热处理等。

　　本发明中典型的样品为体液，如血、血浆、血清、淋巴、尿、唾液、精 液、羊水、胃液、粘痰、痰、粘液、眼泪等；环境流体，如地表水、地下水、 淤泥等；和工艺流体，如奶、乳清、肉汤、营养溶液、细胞培养基等。本发 明的实施方案适用于所有样品，但优选适用于体液样品，最优选适用于全血

　　基于样品横向流动和样品中存在的组分与设备中存在的反应物的相互 作用和对这些相互作用的检测的定性的或者定量的测定，可用于任何目的，

　　例如诊断目的、环境目的、质量控制目的、调节目的、法医目的或研究目的。 这些检测通常是指色谱分离法实验或横向流动实验，例如免疫色谱实验。

　　诊断确定的示例包括，但不限于，测定不同疾病特异的分析物(也称为 标记)，例如慢性代谢疾病，如血糖、血酮、尿糖(糖尿病)、血液胆固醇(动 脉粥样硬化、肥胖等)；其它具体疾病的标记，例如急性病，如冠状动脉梗 塞标记(例如肌钙蛋白-T),曱状腺功能的标记(例如测定促曱状腺激素 (TSH))，测定病毒感染的标记(使用横向流动免疫实验检测具体的病毒抗体)； 等。

　　诊断测定的另一重要的领域涉及妊娠和生育力，例如妊娠检测(一般测 定人绒毛膜(hCG)),排卵检测(一般测定促黄体激素(LH)),生育 力检测(一般测定促卵泡成熟激素(FSH))等。

　　另 一重要领域为药物检测领域，用于方便和快速检测指示药物滥用的药 物和药物代谢物；例如确定尿样品中的具体药物和药物代谢物(例如THC)等。术语分析物是术语标记(marker)同义词，且意思是包括任何定量或定 性确定的物质。

　　在本说明书、实施例和权利要求中的术语区(zone),区域(area)和位 点(site)是用来定义衬底上的流体通道(流体通道)的各部分，或者在现有 技术设备中或在本发明实施方案的设备中。

　　术语反应是用来定义任何反应，其发生在样品组分和在所述衬底上或 衬底中的至少一种反应物或几种反应物之间，或发生在存在于所述样品中的 两种或多种组分之间。术语反应特别用于定义发生在分析物和作为所述分 析物的定性或定量测定部分的反应物之间的反应。

　　术语基底在此是指向其中添加样品的载体或基质(matrix),在其上或 其中进行测定，或在其中发生分析物和反应物间的反应。

　　术语化学功能度(functionality)包括进行或促进实验所需的任何化合物 或化学部分。与本发明特别相关的 一组化合物是显示与样品中的 一种或多种 组分具有特异的亲和力或结合能力或能与其相互作用的化合物或组分。红细 胞分离剂是一种说明性示例。这些试剂可为任何能聚集或结合红细胞的物 质。

　　术语生物功能度.包括样品中组件和衬底上或衬底中的反应物间的所 有生物的相互作用，如催化、结合、内化、活化或其它生物特异的相互作用。 合适的反应物包括，但不限于，抗体、抗体片段和衍生物、单链抗体、凝集 素(lectines)、 DNA、适体等，包括其它具有结合能力的聚合物或分子。这些 反应物可由本领域技术人员，选择待分离的组件后，使用标准实验法，例如 筛选方法和化学图书馆确定。

　　术语物理功能度在此包括在反应和相互作用中涉及的主要不为化学 或生物的功能度。示例包括直径、高度、形状、横截面、表面形貌和表面图 形、每单位面积的凸起(projection)数、所述凸起的表面润湿特性或其组合， 和/或其它影响样品组件的流动、保持、粘附或排斥的功能度。

　　化学、生物和物理相互作用之间的区別不总是清楚的，可能相互作用-如在样品中组分和衬底上的反应物之间的相互作用-涉及化学、生物和物理 区域。

　　术语亲水的和疏水的，如在亲水的或疏水的化合物、亲水的或疏水 的相互作用中等，具有本领域技术人员通常理解的意思，且与通常认可的教

　　本发明提供的实验设备包含盖和基底，所述基底包含样品加入区、反应 区和吸收区，所述各组件流体连通，且作为样品加入区至吸收区的流体通道

　　的部分，其中(a)样品加入孔集成在盖中(b)吸收区包括无孔衬底上的区域，具 有基本上垂直的凸起，所述凸起限定的体积与流体通道的体积一起限定进行 实验的样品体积，和(c)至少一个过滤器在样品加入孔和样品加入区之间。

　　本发明的实施方案涉及一种设备，其包括至少 一个用于流体传送的流体 通道，该流体通道具有第一端和第二端；和特别采用的吸收区来建立、保持 和/或计量通过所述至少一个流体通道或沿所述至少一个流体通道的流体传 送，其中所述吸收区包含具有衬底表面的无孔衬底，所述区具有基本上垂直 于所述表面的凸起，且所述凸起具有高度(H)、直径(D)和在凸起间的距离(tl, t2)，使得在所述区中实现所述流体的横向毛细流动。

　　其它实施方案涉及处理在衬底上或衬底中的至少一个流体通道中或沿 所述至少一个流体通道的流体传送的方法，其中通过在与所述通道接触的流 体中设置吸收区，建立和/或保持和/或计量所述通道中的流体传送，且所述 吸收区包含由无孔衬得的区，所述区具有基本上垂直于所述表面的凸 起，且所述凸起具有高度(H)、直径(D)和在凸起间的距离(tl, t2),使得在所 述区中实现所述流体的横向毛细流动。

　　在本发明的设备中，设备的容量(capacity)由吸收区限定的体积精确地确 定。当样品过量添加时，由于明确定义的和可再生的无孔结构，进行实验的 体积将总是相等的。因此可通过恰当的选择基本上垂直的凸起的尺寸、它们 的直径、高度和凸起间的距离以及通过调节它们的化学、生物或物理特性(例 如通过用合适的化合物涂覆该凸起)来影响和控制流速。根据一个实施方案， 所述凸起通过加入葡聚糖而变为亲水的。流速也可进一步通过选择合适亲水 程度的箔而调节，或通过选择用于将箔附接至凸起的合适程度的粘合剂而调 P 。

　　本发明的实验设备包含样品加入孔。所述样品加入孔集成在盖中。本实 验设备进一步包括至少一个过滤器。所述样品加入孔和过滤器一起使样品得 到更好的分离。将样品加入孔集成在盖中的优点为在样品加入孔不会发生泄 漏。样品加入孔给予以下保护，其防止液体样品的小液滴在样品加入时飞賊。

　　附加的过滤器使设备对红细胞压积的变化不敏感或较少敏感。所述实验设备包括分离样品中组分的过滤器。过滤器优选为能从血浆分 离红细胞的亲水的聚合物膜，优选没有溶血作用，没有非特异的蛋白结合，

　　可将箔设置在凸起上，从而精确地限定凸起间的体积，该体积一侧由衬 底表面所限定，另一侧由所述箔限定。出人意料的是加入箔影响了吸收区的 毛细作用，且通过选择合适的箔材料和粘结该箔的粘合剂，吸收区的亲水性 质可按需要调节。

　　根据本发明的设备实践中是封闭的，且需要使用者给予最小的相互作 用。 一旦加入样品，仅需要将设备插入读出结果的装置中。从设备泄漏样品 是不可能的，这使读数器污染的风险降到最低。所述设备易于制备，且在其 优选的实施方案中，仅由几部分或仅由两个主要的组件(支持体和盖)组成。 所述盖用来防止支持体的特征受环境、粉尘污染、机械损坏等的影响。

　　而且，该构造和从下面通过无孔衬底读出结果的原理也帮助产生封闭的 系统，并防止读数器污染，因为包含样品(例如患者样品)的表面不与读数器 或使用者接触。所述盖也提供用于标记和条形码的区域。所述设备的其他优 点包括其不需要拆卸来确定实验结果。

　　然而，可以考虑该设备可具有与盖相对的部件。底部可被看作是与流体 通道相对侧上的部件。底部防止基底的另一侧发生机械损坏、污染等，该机 械损坏、污染等会影响实验结果的测定。底部优选具有孔或其它能够读出实 验结果的装置。根据一个实施方案(未示出)，所述设备具有保护设备基底的 滑动装置，但可以在实验结果测定前将其移除或替换。在一个实施方案中， 所述底部具有至少一个开口，使得可以读取基底。

　　在一个实施方案中，基底之上的气室通过例如至少一个小开口仅以非常 小的程度与周围空气接触。这具有以下优点，内部空气将会被来自样品的溶 剂蒸汽饱和或接近饱和，从而防止或延迟样品的进一步千燥。因此，该特别 的实施方案导致基底上的样品更缓慢千燥。这种实施方案的一个示例为具有 不透光的盖，或底部和盖的实施方案。

　　优选实施方案中还有该流体通道，是由明确定义的结构组成，可以逐个检测按照相同的配置来生成，体积、容量或性能的变化不存在或可以忽略。

　　图1显示本发明实施方案的分解图，其中在衬底或基底1的表面通过基 本上垂直于所述表面的凸起形成流动路径或流体通道2。这些凸起具有直径、 高度和在它们之间距离，使得实现了横向毛细流动。这些凸起优选对其化学、 生物或物理功能度修改，且给予亲水性，例如通过加入葡聚糖。

　　在衬底表面，即基底表面，形成有样品加入区3。所述区可包括基本上 垂直的凸起，但也可为衬底中的凹窝或孔。可以考虑的是该样品加入区至少 部分包括所述基本上垂直的凸起。图1示意性显示一种实施方案，其中样品 加入包括基本上垂直的凸起，但其中所述基本上垂直的凸起与构成流体通道

　　靠近样品加入区，在流动方向上，检测结合体被预分配于区域4中。或 者，该检测结合体被预分配于样品加入区中。在流体通道2的末端是吸收区 5，包括基本上垂直的凸起。

　　根据一个优选的实施方案，所述吸收区被箔6覆盖，该箔与衬底表面和 凸起一起限定了一定体积。

　　在一个实施方案中，在样品加入孔中存在防止吸量管穿透过滤器的设 备。在一个实施方案中，该窄开口适合于待与设备一起使用的吸量管，使得 该开口不允许吸量管完全插入穿透该开口。在一个替代的实施方案中，成形 所述设备以使开口的几何形状和吸量管相互作用并防止吸量管插入使得其 损坏过滤器。

　　图1进一步显示盖7如何设置在基底1上。盖7具有至少一个表面8用 于携带信息，例如印刷的信息、文字、图片、条形码等。在盖上也设置有样 品加入孔9，具有样品预处理过滤器10。

　　图2中所示的侧视示了样品预处理过滤器如何与样品加入区3上存 在的凸起接触。168体育该侧视图还表明盖7可以弹簧锁(snap-lock)的方式附接至基 底1。其也可以被胶合、焊接或其它方式附接至基底。本领域技术人员将选 择合适的方法来将盖附接到基底。

　　也可考虑该盖至少部分延伸出基底的底部表面，以防止基底划痕、灰尘 或其它污染，或其它可能损害实验结果的读数的影响。

　　本上垂直于基底表面的凸起以及被箔6覆盖的吸收区。该细节显示凸起的尺寸、直径、高度和凸起间距离如何测量。

　　图4显示具有底部11的本发明的可选实施方案。除了底部外示出了基 底l,其包含基本上垂直于所述表面的凸起。所述凸起具有直径、高度和它 们之间的距离，使得实现至少一种毛细流动。在该具体实施方案中，存在一

　　个被箔6覆盖的吸收区5，与基底的表面和凸起一起限定了体积。存在罩或 盖7保护该设备。在盖中集成有样品加入孔9。在样品加入孔9和样品加入 区3之间设置有样品预处理过滤器1.0。该设备进一步包含具有开口的底部 11。该开口使得可通过读数器读数基底1。

　　如WO 03/103835所述的微柱结构由Amic AB、 Uppsala, Sweden制备且 用于形成样品加入区、反应区和吸收区。多个检测结构在1 mm厚的热塑性 盘上制备，将其切成带，每个具有包括垂直的凸起或微柱的流体通道或开放 的流动通道。用于制备盘的材料是Zeonoi⑧(Zeon Corp., Japan),具有优异的 光学特性的环烯烃聚合物。

　　包括待检测结构的正底版(positive master)通过在二氧化硅中蚀刻该结构 而制备，而负模使用所述二氧化硅底版用镍制备。多个检测结构通过对着负 模热塑性挤压而制备，在1 mm厚的聚丙烯盘上制备该结构，将其切成带， 每个具有包括垂直的凸起或微柱的流体通道或开放的流动通道。

　　该微柱具有以下尺寸高度69 _im，直径46 im且以约29 pm的相互间 距放置。该流动通道具有长度为25 mm和宽度为5 mm。 最后的5 mm用作 吸收材料的支持体，限定吸收区为约5 x 5 mm。

　　结果表明在流体通道、凸起和吸收过滤器材料间形成了良好运行的界 面，且获得了显著的流速。

　　聚氨基甲酸酯泡沫原位固化于设备上流动通道的远端包含垂直凸起的 区域中。该泡沫填充凸起间的间隔，提供与剩余的流动通道的良好流体联通。 泡沫吸收100 ul的时间对不同样品测量三次。结果(表3)显示泡沫可作为吸 收区且获得相关流动。预期到优化泡沫的孔隙度、固化和其它性质将导致更好的流速。表3.

　　制成的检测带具有的流体通道包括微柱区域或导入微柱区域，该微柱具 有以下尺寸高度69 am 、直径46 (am且相互间距约29 jim。该流动通道具 有长度约25 mm且宽度为4 mm。相对于样品加入区的远端(distal end)覆盖 有粘附箔。检测具有亲水和疏水粘合剂的不同的箔(样品由Adhesives Research Inc. USA提供)。

　　14寸吏用磷酸盐緩沖盐水(加入0.015 % Tween-20)检测流动。结果示于表4。 表4.箔对微柱结构中流速的影响

　　结果显示用亲水的箔覆盖较宽的流体通道(4 mm)的远端显著增加流速。 可能的是更窄的流体通道(2 mm)中获得的较J 、改进是由于结构差异。在窄流 体通道中，暴露侧的效果变得更大。168体育可以认为，通过调节粘合剂的性质，例 如通过选择不同程度的润湿性能或亲水性，对各种样品流体能够精确地调节流速。

　　供显著增加了本发明设备中的吸收能力和流速。使用紧密设置在凸起或微柱 结构上的箔的实验显示其不仅非常精确地限定了体积，而且也影响流速。

　　尽管本发明已经通过包含本发明者所知的最佳实施方式的优选实施方 案进行了描述，应理解对于本领域设计人员来说任何改变和修改是显而易见 的，而不偏离本发明的如所附权利要求中的范围。

　　1. 实验设备，其包括盖和基底，所述基底包含样品加入区、反应区和吸收区，所述各组件流体连通，并且作为从样品加入区至吸收区的流体通道的部分，其中a. 样品加入孔集成在所述盖中，b. 所述吸收区包括在无孔衬底上的区域，具有基本上垂直的凸起，所述凸起限定了体积，该体积与流体通道的体积一起限定进行实验的样品体积，和c. 至少一个过滤器位于样品加入孔和样品加入区之间。

　　3. 根据权利要求卜2任一项的实验设备，其中所述实验设备进一步包括底部。

　　4. 根据权利要求l-3任一项的实验设备，其中所述凸起具有高度、直径 和各凸起间的距离，使得在吸收区中实现所述流体的横向毛细流动。

　　5. 根据权利要求l-4任一项的实验设备，其中所述具有基本上垂直的凸 起的吸收区的区域被箔覆盖。

　　7. 根据权利要求5的实验设备，其中所述箔使用亲水物质附接至所述垂 直的凸起。

　　8. 根据权利要求l-7任一项的实验设备，其中所述至少一个过滤器为能 从血浆分离红细胞的亲水性聚合物膜。

　　9. 根据权利要求l-7任一项的实验设备，其中所述过滤器为能从血浆分 离红细胞的亲水性聚合物膜，且所述过滤器与所述样品加入区中的基本上垂 直的凸起直接接触。

　　10. 根据权利要求l-9任一项的实验设备，其中所述基底为透明的，使 能够读取通过所述基底的结果。

　　11. 根据权利要求l-10任一项的实验设备，包含预分配在样品加入区中 或在样品加入区附近的检测结合体。

　　12. 根据权利要求1-11任一项的实验设备，其中所述样品加入孔包含防 止吸量管穿透过滤器的设备。

　　15.处理全血样品的方法，其中将全血样品置于样品加入孔中，并使用过滤器进行红细胞分离，其中将血浆与流体通道接触，该流体通道包含样品 加入区、反应区和吸收区，其中吸收区和流体通道的体积限定通过反应区的血装体积。

　　16. 根据权利要求15的方法，其中所述吸收区包括无孔衬底上的区域，具有基本上垂直的凸起。

　　17. 根据权利要求16的方法，其中所述凸起具有高度、直径和在各凸起 间的距离，使得在吸收区中实现所述流体的横向毛细流动168体育。

　　本发明提供一种实验设备，其包括盖和基底，所述基底包含样品加入区、反应区和吸收区，所述各组件流体连通，且作为从样品加入区至吸收区的流体通道的部分，其中(a)样品加入孔集成在所述盖中，(b)吸收区包括在无孔衬底上的区域，具有基本上垂直的凸起，所述凸起限定了体积，该体积与流体通道的体积一起限定进行实验的样品体积，和(c)至少一个过滤器位于样品加入孔和样品加入区之间。本发明进一步提供处理样品的方法。